基因组学相关

coursera基因组学相关课程笔记

写在前面：本篇教程来自coursera课程基因组学：解码生命的通用语言、DNA 解码、基因组技术简介

基因组学：解码生命的通用语言

目前生物学的挑战：将生命系统的各个部分（零件）组装起来，了解它们是如何协同运作的

生物学研究围绕基因和蛋白质

水平基因转移：在不同种类的细菌/病毒/其他生物体之间交换遗传物质。大多数物种基因组中，大约又5%-20%来自水平基因转移获得的无关生物。如果这些转移得到的基因对物种没有任何有利影响，则通常会逐渐丢失，而有帮助的则保留，通过这个过程能够以可预测的方式操纵生物。在自然界中，微生物可利用这个机制让抗生素耐药性广泛传播

收集抗生素的方法：

• 过去：收集土壤样本→实验室分离微生物→培养微生物→检测效果→提纯有效分子 仅能检测10%的分子，因实验室纯培养下，微生物90%的抗生素合成基因未激活（无竞争/交流对象、代谢成本高、基因受调控等）
• 现代：微生物基因组测序→通过基因识别判断其是否有合成抗生素的能力→用基因工程等技术大量合成新抗生素

基因相互作用来影响性状表达：一种疾病可能是由于一条代谢途径上多个不同基因表达异常导致的（重要的是途径而不是某个基因），因此需要建立基因互作网络，以了解基因表达在细胞中的协作

共表达基因：表达一起上调/下调的基因，可能来自同一类细胞或以某种方式相关联

表达聚类：不同基因在功能上聚集。对于大量基因，无法逐一测试，需通过“基因聚类”简化研究——识别“在一定条件下始终共同出现”的基因群，挑选1-2个基因作为“代表”间接分析整个基因群

对代表基因的表达位置/功能场景进行定位：

• 免疫组织化学技术：制备目标基因编码蛋白质的特异性抗体，通过抗体在组织切片中定位蛋白质，确定目标基因的蛋白质产物在组织中的分布
• 原位杂交技术：利用目标基因的RNA探针，结合细胞内的目标RNA，找到目标基因在细胞中“被激活（表达）”的部位，明确表达该基因的细胞类型

未知基因功能推断——关联推断法(guilt by association)：根据“聚类基因大概率参与相同生理功能”，若基因群中部分已知基因明确参与某功能，可推测群内未知基因也参与该功能

生物材料：早期为惰性植入物（如金属人工关节），核心是不引发炎症/感染，被动支持细胞；现发展为活性材料（如脱细胞心脏瓣膜），可支持细胞再生——通过各种信号引导伤口细胞启动愈合过程，最终恢复天然组织。形态多样，包括金属、多孔海绵等。用于辅助愈合、新药测试、细胞毒性检测等

细胞的复杂性：同一基因组的细胞可形成多种细胞类型，转录因子的功能也具有多样性（转录因子发挥作用的条件不同）。关键问题是“如何通过调控转录因子的激活顺序或信号传递，引导细胞按预期行动”，因此需要我们理解不同通路的关联，以及不同生理状态下的基因调控机制，从而在工程层面设计出能传递精准信号、引发预期反应的生物材料

哺乳动物肢体形态：所有哺乳动物的肢体骨骼结构高度保守（骨骼种类相同），差异仅体现在骨骼比例、趾数量等方面。所有哺乳动物肢体发育的关键基因完全相同，基因的表达水平/时机/位置导致了肢体骨骼的形态细微变化，而非新基因的出现

• 基因的跨物种保守性：肢体发育的基因调控机制在进化中极为保守，例如调控人类腿发育的基因，许多也调控昆虫腿的发育

基因表达的改变是生物适应环境的核心，基因组编码的信息决定了生物能否快速适应环境

转基因生物GMO：通过基因工程工具修饰基因组（通常是插入外源基因）的生物，例如抗除草剂/抗虫作物、高维生素大米等，实现跨物种基因转移、精准靶向性状

• SoyFACE实验：探索作物对大气条件响应的遗传变异及调控基因，培育能“利用高CO₂”或“耐臭氧”的作物品种，应对未来环境变化
  • 平流层臭氧保护生物，近地面臭氧是污染物，臭氧浓度随环境变化，难以预测，因此管理手段有限，培育耐臭氧基因型的作物可能是更优解
  • 植物通过产生抗氧化物质清除活性氧，不同品系的抗氧化物质含量决定耐臭氧能力
  • 用20-30米环形装置露天操控CO₂和臭氧浓度，模拟2050年预期环境，研究作物响应
  • 植物-昆虫互作：高CO₂环境下，大豆因固定更多碳而叶片糖含量升高，同时氮含量降低；糖会刺激昆虫取食，氮含量低则导致昆虫需更多取食以获取足够蛋白质
• 转基因技术的安全性
  • 转基因技术相比于传统育种：转基因技术精准导入明确的DNA片段（单个基因或代谢途径基因），高度可控；而传统育种全基因组杂交，带入大量未知基因，无法确定未知基因的影响
  • 实际应用：现代奶酪的凝乳酶、动物饲料中添加的氨基酸都来自“转基因细菌”，转基因木瓜等，应用广泛
  • 转基因来源的物质与天然物质化学结构完全相同，目前尚无任何证据表明转基因生物对人类健康有直接影响

基因组的动态性：环境与基因组持续互动，共同影响基因表达

表观遗传学(epigenetics)：不改变DNA序列但修饰基因组、调控基因活性，揭示了环境用于塑造和调控基因组活性的具体机制与结构

• 其中研究最多的是DNA甲基化——在DNA添加化学基团：修饰基因调控区则基因关闭，修饰基因内部则基因开启。使基因组能响应环境信号并分化出不同组织
• 影响因素：行为、环境毒素、氧气含量、心理创伤等

精准医疗(precisionmedicine)：根据个体的基因、环境和生活方式量身定制医疗方案，不同于“一刀切”的治疗（如给所有患某病的患者用同一种药）

• 应用：癌症治疗、妇产科（孕期疾病、早产）、疾病预防
• 问题：基因检测后的分析耗时较长，需要快速实时检测技术

生物标志物(biomarker)：从个体身上获取的、可预测某种疾病状态的指标，例如血脂谱（胆固醇）

• 早期标志物（子痫前期的“症状前标志物”）
• 外周标志物（阿尔茨海默病的血液标志物）

转录因子：一类自身为蛋白质的分子，通过与DNA结合调控基因，决定细胞内表达哪些基因，从而影响细胞分化、组织形成。通过给与细胞不同的外部信号，能调控转录因子的表达

• 结合位点非随机，每种转录因子偏好特定DNA短序列，称为基序(motif)。基序的分布是研究转录因子调控的起点
• 基因调控的刺激来源：细胞内信号、其他细胞信号、外部环境信号，转录因子整合这些刺激——其活性形式的浓度会同时反映细胞内外的刺激信息，最后通过改变与DNA的结合程度来影响基因表达

基因调控网络：基因通过“产物调控产物”相互关联（如基因A的产物调控基因B，基因B的产物调控基因C）

• 基因网络的“初始触发点”可来自“母体细胞继承的蛋白质”（非新细胞自身基因合成），这类蛋白质可启动首个调控环节

发育生物学：是基因调控研究最深入的领域，主要研究“单个细胞发育为完整生物体的过程”，该过程与基因调控密切相关

• 基因调控是否在社会行为中发挥类似作用：差异极大的物种中，相同转录因子调控相似社会行为，说明社会行为可能起源于原始分子程序
• 基因调控（或某些高度保守的基因调控形式与机制）是“不同物种共有行为模式”的核心，在社会行为进化中起关键作用

基因调控的研究技术：

• 染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)：通过染色质免疫沉淀(ChIP)与测序技术结合，对基因组中的每一段DNA进行“打分”，评估转录因子与该段DNA的结合强度，绘制“转录因子与基因组所有位置的结合图谱” 转录因子结合图谱+细胞接收刺激后的变化->被激活的转录因子会启动其结合位点附近的哪些基因->刺激后细胞会发生哪些重大变化
• 计算预测：通过“识别转录因子偏好的基序”，在DNA中寻找潜在结合位点，模拟ChIP实验 问题：存在大量“假阳性基序”（有基序但无转录因子结合），需通过“基序周围的上下文环境”（如辅助序列——为转录因子结合DNA提供必要条件的序列）提高预测精度

测序服务：涵盖从已有文库测序到全新物种基因组从头测序等各类项目，提供“共享资源”，让研究者获取无法独自购买的昂贵设备与专业技术支持

• 第二代测序实现数十亿条DNA片段的并行测序，测序全基因组的时间从10年缩短至数天，成本从数十亿美元降至数千美元。测序结果为包含A/T/C/G碱基序列的大型文本文件，研究者据此可拼接未知基因组或与已知参考基因组比对，分析突变、基因表达等

行为个体差异研究：

• 行为性状受多基因控制且存在上位性相互作用，同时受环境动态调控，不同基因型对环境的响应也存在差异
• 关键问题：行为的一致性和差异性——个体行为长期稳定、种群中存在不同行为类型
• behavioral syndrome（行为综合征？）：种群层面的行为相关性，反映不同行为间的相关性，例如胆子大的个体往往更具攻击性，而胆小的个体往往攻击性较弱；behavioral type（行为类型）：个体层面的行为特征，是种群内行为差异的具体体现，例如“胆大且具攻击性”或“胆小且无攻击性”
• 研究模型：三刺鱼。其研究基础深厚，在每种环境中都表现出对当地环境的局部适应，对选择压力表现出快速适应和趋同适应（不同种群在相似选择压力下进化出相似性状）
• 研究方法：
  • 野外：观察繁殖季行为、标记重捕实验（捕获后测定行为类型，重捕分析不同行为类型的个体在不同生境中的存活情况）
  • 实验室：抗捕食行为、入侵者响应（放入另一条三刺鱼，观察反应）、亲本抚育行为实验（观察雄性亲本抚育行为的个体差异，分析这种差异导致的影响）
• 挑战：行为发生后测定的基因表达无法直接反映之前的行为成因，需要在行为发生前测定基因表达；行为后测定的基因表达，可能通过影响大脑状态，进而影响未来行为的概率，因此需要将基因与行为的关联与我们对大脑的认知整合（基因并非直接作用于行为，而是通过神经回路发挥作用）

母本效应(maternal effects)：个体的生活经历可传递给后代，例如人类母亲孕期的环境条件会影响胎儿发育，进而影响后代成年后的性状；暴露于捕食者的雌性三刺鱼，其子代在诸多方面均存在显著差异（抗捕食行为、学习能力等）

基因组是“先天遗传”与“后天环境”的交互枢纽：环境通过表观遗传修饰影响基因表达，遗传变异与表观遗传均可跨代传递

基因组学在微生物研究中：

• 自然种群中的宿主-病原体共进化研究：观察基因组多样性如何随时间变化，以及哪些因素会影响这些变化
• 具体方法：改变培养条件或人工操控，观察微生物变化；让微生物在培养中共同进化，追踪其进化过程，定位基因变异
• 关键问题：大型生态系统间的相互作用，揭示与人类共生的微生物及其对人类的影响
• 基因组学的核心：分析DNA中编码的序列，并利用这些序列研究进化
• 基因组学的优势：突破单个基因研究的局限，将基因置于生物全部遗传物质中，分析基因间的相互作用；追踪微生物从环境中获取的外源遗传元件（病毒、质粒等）及其进化影响

环境对微生物进化与种群的影响：

• 非生物环境：体积大、稳定性高的热泉微生物多样性更高，因为如果环境变化，会导致其中的微生物被“清除”
• 抗生素选择：携带抗性基因的微生物适合度更高，能在环境中大量繁殖
• 生物竞争：微生物可利用“无害病毒”（对自身无害，但可杀死其它微生物）等作为武器，排斥其他微生物以占据环境，提升自身适合度
• 中性过程：更多受随机性影响，后续变异是否留存依赖选择压力，如空环境的初始定植

人类微生物组：存在于人体内及体表的微生物生态系统。人体内的微生物数量远超人体细胞，且这些微生物基因组中的基因数量，也远多于人类基因组的基因数量

• 微生物的作用：合成维生素、消化氨基酸、分解人类无法消化的碳水化合物等

岛屿种群：对比岛屿与大陆上同物种的进化差异，观察不同环境对进化差异的影响

• 将人类个体视为微生物组的“宿主岛屿”：人体表面及体内各处的环境都不同，存在多种独特的生态系统，每个系统都有专属的微生物群落，且群落内部会发生各种动态过程，具有高度特异性；每个人的微生物组都存在细微差异，因此益生菌需要与个体已有的微生物群落适配
• 粪便移植：将完整的健康微生物群落移植到患者体内——微生物间的相互作用是群落稳定的核心，仅添加单一菌株难以成功

基因组学与光合作用：

• 研究目标：提升光合作用效率以培育高产作物、增强光合作用在气候变化场景（高温、高二氧化碳浓度）下的适应性
• 不同植物的环境可塑性差异显著，可塑性弱的植物在气候变化中更脆弱，因此需要帮助作物快速适应气候变化，而“基因组的表达受环境调控”正是植物可塑性的底层机制
• 大豆等作物的光合作用效率仅约为理论最高效率的1/5，传统育种难以提升这一效率（不同作物的光合效率差异极小，可利用的遗传变异有限），需利用转基因技术——系统优化（增加光合作用中瓶颈基因的拷贝数）或跨物种基因导入（如将光合效率更高的藻类基因转入作物）
• 在计算机上模拟光合作用（用模型呈现相关蛋白质与反应），并通过进化算法（数学模拟）让光合系统进化出更优状态，定位需优化的基因
• CRISPR-Cas9基因编辑技术：若某种蛋白质在高温下易分解，可使用生物物理学得知改变某个核苷酸即可提升其高温稳定性，而基因编辑可精准定位并修改这一个核苷酸，无需导入外源基因
• 挑战：技术层面完全可行，但“单核苷酸编辑的生物是否归为转基因生物”仍存在争议

显微镜成像技术：

• 透明化技术(Clarity)：去除组织中的脂质屏障，使组织透明，防止光线散射和折射率差异影响效果，实现深层成像，同时缩短成像时间
• 共聚焦显微镜/活体层光显微镜：高分辨率成像，适用于活体或固定组织的精细观测
• 跨领域应用：用相机监测热泉中石灰华的生长

基因组学与社会学的结合：

• 低收入黑人女性中社会环境（贫困、暴力）对健康的影响：社区暴力引发的压力如何影响身心健康，以及调控免疫系统的基因功能
• 研究方法：通过访谈了解真实经历、使用量表进行量化评估；采集血液样本，进行转录组分析
• 意义：让她们更深入地参与研究，为精准医疗提供社会维度上的参考，助力缩小健康差距、制定改善黑人社区健康的公共政策；同时揭示社会结构对基因表达的影响

DNA 解码

DNA指纹：利用可变数目串联重复序列(variable numbers of tandem reprat, VNTR)/卫星DNA，人类基因组中存在多个这样的位点，且重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，多态性在于重复单位的重复次数不同

• 从血液/唾液中得到DNA模板（人体基因组），再利用PCR扩增卫星DNA（使用特定引物来控制只扩增指定片段），最后通过电泳显示其多态性

基因组技术简介

人类基因组计划：对30亿个碱基对进行测序，预期是每个碱基1美元，在结束时成本为≈700碱基/1美元，在今天，成本降到了300万个碱基/1美元

重复序列(repeats)：可能对测序结果分析造成影响，因为重复序列高度相似，单次测序仅能读取数百个碱基的短序列，很可能得到一段完全由重复序列构成的读段，此时无法确定它来自基因组的哪个位置

• 串联重复(Tandem Repeats)：相同（或高度相似）的序列一个接一个连续出现
• 散在重复(Interspersed Repeats)：相同（或高度相似）的序列不连续排列，分散在不同染色体的不同位置上

mRNA的两端存在非翻译区(Untranslated Region, UTR)：

• 起始端（5’端）的非翻译区称为5’UTR，通常较短
• 末端（3’端）的非翻译区称为3’UTR，通常较长，具有多种调控功能
• 编码序列位于5’UTR和3’UTR之间

蛋白质的结构决定功能：位于结构内部的部分通常不活跃，而位于表面的部分通常是功能活跃区

遗传变异的人群分层：使用主成分分析，根据基因序列变异聚类

• 结论：人群的遗传聚类与他们的原籍国高度吻合
• 原因：人群倾向于与同一地区的人通婚并生育后代，导致遗传性状在地理上呈现区域化分布

研究基因型与表型关联的核心方法：全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)——通过大样本统计，寻找基因组中与特定性状（疾病或表型）相关的遗传变异，但无法直接证明这些变异是导致性状的原因

• 对比病例组（患病/有性状）与对照组的基因型，寻找差异SNP
• 最后找到与性状关联的遗传变异，但要注意关联≠因果（例如即使已知携带某种SNP的患病概率比不携带高，也不能直接推断该SNP导致患病）

测序技术

聚合酶链式反应(PCR)：使用少量DNA大量扩增DNA片段（每轮循环DNA量翻倍，30轮循环可使DNA量达到初始的约20亿倍）

• 主要底物：目标DNA（模板链）、引物、DNA聚合酶（催化DNA合成）、dNTPs（A/C/G/T，合成DNA的原材料）
• 步骤：
  • 变性（94℃）：DNA双链解链为单链
  • 退火（54℃）：引物与单链DNA互补结合
  • 延伸（72℃）：DNA聚合酶从引物3’端延伸，合成新链

下一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)：对2007年前后出现的最新测序技术的统称

• 特点：自动化、高通量、速度快、成本低
• 主要原理：
  • 先将DNA片段化（通常为几百个碱基）并固定在载玻片上（一块载玻片固定百万~千万个片段），通过PCR形成簇(cluster)，每个簇包含数百万个相同的单链DNA短片段
  • 向载玻片中加入荧光标记（标记是哪种碱基）+可逆终止子（确保每次只添加一个碱基）构成的dNTPs，在每条模板链上添加dNTP时，荧光被激发，此时拍摄图像，荧光信号颜色对应碱基类型
  • 去除终止基团后，碱基继续添加，进入下一轮循环，依次读取下一个碱基
  • 所有DNA簇的测序同时进行，因此一块载玻片上的数百万个簇能在同一时间完成测序
• 误差：误差随循环次数增加而升高（DNA聚合酶催化不绝对精准，可能多添加或未添加碱基，导致产生“超前”或“滞后”的片段，最后同一簇的荧光信号不再单一），因此读长有限（无法读长链）
• 输出结果：读段(read)，每个DNA簇对应一条读段，其中每个碱基附带质量值(quality value)——根据荧光信号的纯度计算得出，反映该碱基的准确概率（循环后期荧光信号杂色增加，质量值会逐渐降低）

下一代测序的应用：

• 外显子组测序(Exome Sequencing)：检测蛋白质编码区（外显子）的基因突变，是寻找疾病相关基因突变的常用技术 外显子(exon)：DNA转录为前体mRNA，前体mRNA被切割为外显子和内含子，内含子被去除，外显子拼接形成成熟mRNA，最后翻译成蛋白质。仅占人类基因组的约1.5%
  • 优势：只需检测极少部分DNA，就能获得所有蛋白质编码区域的信息，大幅降低成本和数据量
  • 流程：提取全基因组DNA并片段化，使用外显子捕获试剂盒（磁珠结合外显子），磁珠分离捕获外显子片段，NGS测序
• RNA 测序(RNA-seq)：分析细胞中基因的表达情况（哪些基因激活、表达量）
  • 流程：提取细胞中的总RNA，使用带有poly T的载体特异性捕获成熟mRNA（只有成熟mRNA3’端带有poly A尾），逆转录为cDNA后NGS测序
• 染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)：确定特定蛋白质（如转录因子）在DNA上的结合位点
  • 流程：取目标细胞，通过化学方法将细胞内的蛋白质固定在其结合的DNA位点上；将交联后的DNA-蛋白质复合物切割成数百万个短片段（其中只有少数片段有DNA蛋白质结合区）；使用针对目标蛋白质的特异性抗体将复合物片段分离；去除捕获复合物中的蛋白质，对DNA片段NGS测序
• 亚硫酸氢盐测序/甲基化测序(Bisulfite Sequencing)：检测DNA的甲基化位点（表观遗传修饰）
  • 原理：甲基化通常发生在碱基C上，亚硫酸氢盐能将未甲基化的C转化为U，比对处理前后的测序结果即可找出哪个C被甲基化
  • 流程：将待检测的DNA分为两份完全相同的样本，对其中一份样本进行亚硫酸氢盐转化，另一份样本不处理；均NGS测序，比对测序结果

基因组学中的计算机科学

计算机科学基础知识

三大研究方向：

• 理论：研究“计算机能做什么”、“哪些问题可被计算”的理论性工作
• 系统：对计算机本身的研究，包括开发操作系统、设计编程语言等
• 应用：计算机的实际用途（用计算机解决其他领域问题）

计算机科学的一个重要核心：用计算思维思考——将问题拆解为“计算机可精确执行的任务”

操作系统的核心功能：数据传输、程序管理、多处理器管理

计算机系统的其它重要方向：编程语言设计、工程（编写、测试代码）、硬件相关研究

算法(algorithm)：一套清晰、分步的操作指令，是详细描述如何完成某件事的方法，无需依赖计算机

• 设计高效算法的核心思路：用更少步骤、更少时间、更少内存完成任务 旅行商问题：考虑卡车的装载量、投递路线灯光因素，设计一条能覆盖所有这些住户的路线，投递完所有邮件后再返回仓库补货

如何更高效地存储：

• 更高效的存储方案：例如存储多序列比对数据时，由于序列间存在大量共性，无需存储所有完整序列，只需存储序列间的差异；用2bit表示1个碱基（A=00、C=01、G=10、T=11）；内含子两端序列中，用各碱基在该位置出现的概率代替序列信息
• 快速查找数据：例如基因组序列中，添加染色体+起始位置标签，快速查找短序列
• 高效数据结构：若多段序列在基因组中位置相近，可在这些序列间建立指针关联，这样找到一个序列后，无需从头扫描，就能通过指针快速定位其他相近序列

软件工程：除了“软件能做什么”，更包括“软件的可靠性”、“处理场景的完整性”、“是否符合预期性能”

基因组学中的计算机科学

软件工程与基因组学结合：RNA编辑(RNA editing)的误判问题，细胞在转录后编辑了RNA中的某些碱基，导致RNA序列和DNA序列不完全匹配，最后产生不同蛋白质，是基因调控的重要方式

• 思路：对同一人的DNA和RNA测序，理论上不匹配的位点就是RNA编辑位点
• 使用比对软件处理大量序列数据时可能出错：比对软件的准确率可能高达99.999%，但在数百万条序列中，百万分之一的错误率仍会导致数百个错误比对结果。如果仅依赖软件输出的不匹配位点，而不进行验证，就就可能将软件的比对错误误判为新的RNA编辑位点
• 启示：程序正常运行并输出结果不代表结果无bug。若不验证结果的可靠性，就可能得出错误结论

计算生物学软件：将原始数据转化为有用信息，将这些信息用于发现生物学规律和指导实验设计

分析流程(pipeline)：“将原始数据依次输入一系列程序，每个程序对数据进行处理，最终输出可用于生物学发现的浓缩数据或结论”的过程，具体包括

• 原始数据文件→数据清洗（去除噪声）
• 数据汇总/组装（序列间比对/与参考基因组比对）
• 进一步浓缩数据，输出可理解的结果

例：RNA-seq分析流程——输入为测序得到的短读段，输出为基因列表及对应的表达量，以Tuxedo pipeline为例

• Bowtie：将RNA短读段与人类基因组比对，生成比对结果
• TopHat：处理跨外显子的读段（RNA经剪接去除内含子，单个读段可能对应基因组上间隔较远的区域）
• Cufflinks：将比对结果组装为基因，并计算基因的表达量、比较多样本的表达差异

软件的选择与更新：

• 不同软件可能输出不同结果，例如Bowtie2和BWA，即使对于两款软件均比对成功的读段，也可能比对到基因组的不同位置
• 需要关注计算生物学软件的最新进展，并了解各软件的优劣；明确研究目标，以此为基准选择软件（例如仅被一款软件比对成功的读段可能是需要关注的关键数据
• 测序技术不断发展，若用3-4年前的软件处理最新的测序数据，可能输出错误结果，即使程序可以正常运行

基因组学中的统计学

基本原则与概念

一些基础概念：

• 总体(Population)：研究关注的所有个体/样本集合，通常无法直接全部检测
• 样本(Sample)：从总体中通过概率抽样获取的部分个体/样本，需具有代表性
• 统计推断(Inference)：根据样本特征推断总体特征，若抽样方法合理则会具有较高可靠性

统计学核心准则：针对特定总体，通过概率抽样获取样本，利用统计推断分析总体特征，并量化推断的变异性

• 利用概率从总体中抽取少量样本，通过样本特征推断总体特征
• 量化推断的变异性：由于仅测量样本而不是总体，推断结果必然存在不确定性，需要评估这种推断有多大概率是准确的

数据共享：基因组数据分析中不可或缺的环节，一套完整的共享数据集应包含四部分

• 原始数据(Raw Data)：未经过任何处理、计算、汇总或删除的数据，基因组研究中通常是原始测序读段（FASTQ/BAM文件） 是相对概念，测序仪输出的序列读段对研究者而言是原始数据，但测序仪生成读段的原始图像对测序仪操作人员而言才是原始数据
• 整洁数据(Tidy Data)：经过处理和清洗，易于分析和交互的数据，需要具备四个条件
  • 每列对应一个变量
  • 每行对应一个观测值
  • 每种数据类型对应一个表格
  • 若存在多个表格，需有关联标识(linking indicator) 例如基因组数据可分为测序数据和样本表型，两者通过样本id关联
• 代码本(Code Book)：描述整洁数据中的每个变量及其取值，包括变量名称、含义、单位等无法直接嵌入数据文件的信息
• 流程说明(Recipe)：从原始数据生成整洁数据和代码本的完整步骤，常用形式为脚本(script)——无需原分析者干预，任何人都能运行的指令集合，例如R和Python代码，输入为原始数据，输出为整洁数据，且不包含任何需手动调整的参数 若无法提供脚本，需提供详细的步骤说明，包括所有软件的版本、参数设置等，但不推荐这种方式

数据可视化（绘图）的核心原则：

• 展示原始数据：在均值+置信区间基础上，叠加了原始数据点，这样就可以展示样本量大小、判断是否存在异常值
• 合理处理重复数据：例如分析技术重复（同一样本重复检测）时，常用散点图（x轴为重复1，y轴为重复2）判断相关性，此时为避免大量数据集中在某一小部分区域，需进行数据缩放（对数转换等方法）
• 选择合适的绘图类型：例如比较两样本时，除了散点图，还可用Bland-Altman图（x轴为两样本值的和，y轴为两样本值的差），可以更直观展示“低表达基因的差异更大”
• 避免Ridiculograms（荒谬图？）：外观精美但信息量极少的图，因为统计绘图的核心目标是传递信息，而非美观，需确保图的可读性和信息密度

样本量的计算：

• 应基于总体变异性，而不是预算（样本量=总预算/单次检测成本）
• 核心是检验效能：若总体中存在真实效应，实验能检测到该效应的概率，取决于样本量、两组均值差异（效应量）、数据变异性（标准差） 检验效能曲线：效应量-样本量，效应量越大、样本量越大，检验效能越高。在实验设计前可通过该曲线判断“当前样本量能否检测到预期效应”
• 若已知效应方向（例如某癌症样本的某基因表达量一定高于对照样本），可适当减少样本量，因为方向信息可以降低推断的不确定性

基因组数据的三种变异性：

• 表型变异性(Phenotypic Variability)：组间差异，例如癌症样本和对照样本，是关注的重点
• 测量误差(Measurement Error)：所有基因组技术都存在误差，需考虑仪器检测精度、读段定量准确性等
• 自然生物变异性(Natural Biological Variability)：即使两个健康、表型完全一致的的个体，其基因组指标也存在差异 新技术可能降低测量误差，但无法消除自然生物变异性

统计显著性与P值

t-statistic：(Y组均值-X组均值)/变异性度量

• 变异性度量：由Y组方差和X组方差计算而来
• 核心逻辑是：用变异性度量衡量均值差异，若差异在变异性度量下很大（t值大），则差异可能真实，反之差异则可能是由随机因素导致

零假设(null hypothesis)：假定为真的某种假设，通常表达为总体参数等于某个固定值。 例如，“这个群体的平均年龄是50岁”、“这个药物对治疗癌症没有作用”等等

P值：在零假设成立的条件下，观察到当前统计量或更极端统计量的概率，用于评估观察到的数据与零假设下期望的数据之间的差异。不是零假设或非零假设成立的概率，也不代表统计证据的强度（如P=0.001不代表证据比P=0.05更强）

• 计算P值：将两组标签随机打乱（如部分X组样本被分配到Y组，部分Y组样本被分配到X组），多次重复该过程，得到随机统计量分布（理论上不应存在组间差异）；P="随机统计量绝对值"≥"原始统计量绝对值"的次数/总置换次数
• “P<0.05为显著”的指标实际上并无科学依据，只是约定惯例，不能过度依赖

多重检验问题：同时分析多个数据集，例如分析“全基因组所有基因的表达”、“数十万甚至数百万个DNA变异”，传统的P值判断不适用于同时进行大量假设检验

• 多重检验的核心问题：P值的均匀分布——当零假设成立（两组无差异）时，P值服从0-1的均匀分布（5%的P值<0.05，20%的P值<0.2，以此类推），这意味着即使两组无关联，若进行1000次检验，也会有50次P<0.05
• 解决方法：两种关键误差率
  • 家族错误率(Family-Wise Error Rate, FWER)：在所有检验中，至少出现1个假阳性（无差异却判定为有差异）的概率。若FWER控制在0.05，意味着所有检验中，假阳性的概率≤5%。适用于不允许任何假阳性的场景（如药物安全性检验）
  • 错误发现率(False Discovery Rate, FDR)：在所有判定为显著的结果中，假阳性所占的比例。允许存在少量假阳性，适用于需发现更多潜在关联的场景（如基因组关联研究） FDR下显著结果更多不代表真实差异更多，仅因误差率标准不同
• P值hacking：通过调整数据或分析方法，人为制造统计显著的结果，即使原始分析无显著关联 需要在查看数据前，预先制定数据分析计划并严格执行，不随意更改检验方法、样本量或变量定义；并如实报道阴性结果（P>0.05），避免仅发表显著结果

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混杂因素：与两个变量都相关，且可能导致“两个变量看似有关联，实则无直接关联”的变量。例如成年人鞋码大、识字能力强，小孩子鞋码小、识字能力弱，错误结论“鞋码大小影响识字能力”，实际上年龄才影响识字能力，这里“年龄”就是混杂因素

• 基因组研究中最常见的混杂因素：批次效应——因样本检测批次不同导致的虚假差异，来源包括检测技术变化、试剂批次不同、仪器状态差异、样本储存条件变化等等。例如“不同种族的基因表达差异”的研究，发现78%的基因显著差异表达，原因是欧洲裔样本和亚裔样本检测时间不同，导致了批次效应

如何避免批次效应：

• 随机化(Randomization)：将实验组和对照组随机分配到不同批次，打破处理组与批次的关联。例如每批检测都包含“部分癌症样本+部分健康样本”，避免“一批全是癌症样本，另一批全是健康样本”
• 分层(Stratification)：针对已知的混杂因素（如性别、检测日期），在实验设计阶段就平衡分组。例如某小鼠实验需“20只雄鼠、20只雌鼠，每组10只作为实验组、10只对照组，每天检测4只”，实际操作中应该“每周检测雌性实验组、雌性对照组、雄性实验组、雄性对照组各1只”，而不是“第一周检测所有雌性对照组，第二周检测所有雄性实验组”

如何避免批次效应的其它方法：

• 平衡设计：实验组与对照组的样本量尽可能相等
• 重复检测：技术重复（同一样本重复检测，评估技术稳定性）和生物重复（重复检测不同个体的样本，评估生物变异性）
• 设置对照：阴性对照（已知无效应的样本，验证技术无假阳性）和阳性对照（已知有效应的样本，验证技术能检测到真实效应）

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